CTLA4敲除小鼠模型
討論與結論
為了研究Npsn在斑馬魚中性粒細胞中的功能，我們運用CRISPER/Cas9技術對斑馬魚npsn進行全基因組敲除，并且獲得了一系列npsn基因發生移碼突變的突變體斑馬魚，比如在exon5-Cas9靶點獲得的（-7，+0）（npsnsmu5）突變體，和在exon6-Cas9靶點處獲得的（-0，+1）（npsnsmu6）突變體，并且經預測它們的蛋白結構相對于野生型斑馬魚出現移碼突變和提前終止。但是我們通過WISH檢測發現在npsnsmu5突變體斑馬魚中，npsn的信號幾乎是缺失的，并且qRT-PCR結果也同樣證明了在npsnsmu5突變體中npsn的mRNA水平下降到野生型斑馬魚的5%左右，可能是由npsn的無義突變導致了mRNA的全面降解所導致的。但是npsnsmu5純合突變體胚胎能夠正常存活到成年，大小和體型正常，并且是可以正常的產生后代。
為了研究Npsn缺陷是否影響斑馬魚中性粒細胞的發育，我們通過斑馬魚中性粒細胞特異性標記基因mpx和lyz的整體原位雜交，發現npsnsmu5突變體和野生型斑馬對比，mpx+和lyz+信號點的數量沒有明顯差別。蘇丹黑染色也同樣發現SB+陽性細胞的數量也沒有差異。并且進一步在DIC下觀察npsnsmu5突變體和野生型斑馬魚中性粒細胞中的顆粒，也未發現明顯區別。以上結果表明，Npsn缺陷并不顯著影響斑馬魚中性粒細胞的發育和數量。這可能是因為Npsn只是斑馬魚中性粒細胞中的一種酶顆粒，缺失后并不影響中性粒細胞的發育，但是可能影響了中性粒細胞的某些功能。
為了研究Npsn缺陷對斑馬魚中性粒細胞功能的影響，而中性粒細胞的主要功能是參與機體的固有免疫反應，因此我們做了斑馬魚大腸桿菌的侵染實驗。我們利用顯微注射的方式感染npsnsmu5突變體和野生型斑馬魚胚胎的卵黃囊，通過記錄并比較感染后兩者的生存率，發現npsnsmu5突變體在感染大腸桿菌后生存率相對于野生型胚胎顯著下降，體內殘余的菌量明顯上升，并且在感染的早期階段，npsnsmu5突變體中炎性因子的表達水平比野生型明顯升高，這說明了中性粒細胞在抵抗細菌感染中存在功能缺陷。為了進一步驗證Npsn在中性粒細胞抵抗感染中的作用，我們通過構建斑馬魚Npsn過表達的轉基因系Tg(hsp:Myc-npsn)，并且同時感染大腸桿菌，發現Npsn過表達后能顯著提高感染后斑馬魚的存活率。這個結果進一步表明，斑馬魚Npsn有助于斑馬魚抵抗細菌感染。
但是Npsn通過哪種方式來幫助中性粒細胞抵抗感染的呢？先前有體外實驗證明，鯉魚的Npsn能夠水解纖連蛋白和明膠，而這兩種組分又是細胞外基質的重要成分，那么Npsn是否通過影響斑馬魚中性粒細胞的遷移來影響對大腸桿菌的抵抗的呢？為了驗證這個觀點，我們觀察了在感染后4小時時傷口處中性粒細胞的數量，但是比較npsnsmu5突變體和野生型斑馬魚并沒有發現明顯差異。另外，Npsn作為一種水解酶，它能否能夠直接水解和破壞大腸桿菌細胞的完整性，進而影響大腸桿菌在機體內存活的呢？并且Npsn缺陷主要影響斑馬魚清除哪種類型的菌呢？為了驗證這些問題，我們也將npsnsmu5突變體斑馬魚和野生型斑馬魚同時感染了其他類型的菌，如革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌和革蘭氏陰性菌銅綠假單胞菌等，發現Npsn缺陷后可能增加斑馬魚對革蘭氏陰性菌的敏感性。但是Npsn影響斑馬魚中性粒細胞抵抗細菌感染的具體機制，還需要更多的實驗來驗證。另外npsnsmu5突變體可以作為斑馬魚免疫與炎癥反應模型，對研究在感染過程中，中性粒細胞與病原菌的相互關系，以及對研發新的抗菌藥物具有重要的指導意義。
生物安全性
動物模型的制備和應用實驗必須在具備相應資質的實驗室開展。動物模型的制備、應用過程中的監督管理、處置措施、對環境和生態影響等應符合國家相關法律規定。
評價驗證
4.1CTLA4敲除小鼠模型的建立
將F0代小鼠與C57小鼠進行雜交，獲得雜合子CTLA4 +/-,將雜合子互交并將子代進行基因型鑒定（圖2），得到純合敲除小鼠CTLA4 -/-。
圖2 PCR鑒定子代小鼠基因型
注：使用PCR鑒定子代小鼠基因型，突變可傳代。M：Marker（TaKaRa，DL2000）；H: 水。-/-：CTLA4基因敲除純合子小鼠；+/-：CTLA4基因敲除雜合子小鼠；+/+：野生型小鼠。
4.2CTLA4敲除小鼠生存率及體重變化
早有研究表明，CTLA4基因敲除小鼠會在出生后1月內，由于嚴重的自身免疫疾病死亡。我們統計了小鼠出生后的生存率及體重變化，CTLA4基因敲除小鼠在出生后3-5周內死亡（圖3a）。CTLA4基因敲除小鼠在出生后2周時體重與野生型小鼠相差不多，但在3-4周時體重明顯輕于野生型小鼠（圖3b），體型也更小（圖3c）。
圖3 CTLA4基因敲除小鼠生存率及體重變化
注：a：CTLA4基因敲除及同窩野生型小鼠出生后8周內的生存率，CTLA4基因敲除小鼠在出生后3-5周內死亡（n=8）。b: CTLA4基因敲除及同窩野生型小鼠出生4周內的體重變化，CTLA4基因敲除小鼠在出生2周后體重增長緩慢（n=6）。c：CTLA4基因敲除及同窩野生型小鼠體型對比。
4.3CTLA4敲除小鼠組織中蛋白表達
為了鑒定轉基因小鼠是否在蛋白水平發生CTLA4敲除，取1-2月齡小鼠脾、肺進行Western Blot，分別使用種屬反應性為小鼠、大鼠和人的CTLA4抗體檢測蛋白表達（圖4）。
圖4CTLA4在敲除小鼠中的蛋白及mRNA表達
注：+/+：野生型小鼠；-/-：CTLA4基因敲除純合子小鼠。
4.4敲除CTLA4基因可導致自身免疫疾病
文獻報道，CTLA4基因敲除小鼠會由于嚴重的自身免疫疾病，在出生后3-4周內死亡，這與我們觀察到的結果相似。HE染色結果顯示，CTLA4敲除小鼠表現出淋巴樣細胞向非淋巴組織（如心臟、肝臟）的浸潤（圖5b，d）。
圖5組織中淋巴細胞浸潤
注：在CTLA4-/-小鼠中，淋巴細胞廣泛浸潤到非淋巴組織中（b, d），圖中顯示的是心臟（a，b）和肝（c，d）的組織切片HE染色。比例尺=100μm。
制備方法
3.1.4 模型構建流程
利用CRISPR /Cas9 技術，建立CTLA4基因敲除小鼠模型，利用PCR、RT-PCR和Western Blot 的方法進行鑒定及分析。
3.1.5 CTLA4敲除小鼠的建立
3.1.5.1 CTLA4敲除小鼠模型的建立
（1）設計方案
一、載體構建
1.sgRNA 載體
載體名稱：pUC57-sgRNA expression vector
Addgene ID: 51132
根據基因信息選擇靶點，合成sgRNA（上海英濰捷基）
targeting site 1:
gggttcaaacacatctcaagg
m-ctla4-gRNA up1 5’TAGGgggttcaaacacatctca
m-ctla4-gRNA down1 5’aaacTGAGATGTGTTTGAACCC
targeting site 2:
gagacttctggaacatggaGg
m-ctla4-gRNA up2 5’TAGGgagacttctggaacatgg
m-ctla4-gRNA down2 5’aaacCCATGTTCCAGAAGTCTC
合成的sgRNA單鏈通過退火復性結合成小片段，插入BSAⅠ線性化的載體
sgRNA插入位點示意圖
圖1CTLA4敲除小鼠模型構建設計方案
構建完成的sgRNA載體通過體外轉錄成為可注射的sgRNA。（體外轉錄用試劑盒：Ambion Am1354）
2，CAS9 載體
載體名稱：pST1374-NLS-flag-linker-Cas9
Addgene ID: 44758
載體通過體外轉錄成為可注射的Cas9-RNA（體外轉錄用試劑盒：Ambion Am1345）
顯微注射：
1、超數排卵：15只3-4周齡c57雌鼠注射激素進行超排。
2、受精卵注射：取約150枚受精卵進行注射。
3、雄鼠結扎：制作30只8周齡輸精管結扎的c57雄鼠。
4、受體鼠制備：8-10周齡ICR雌鼠與結扎的ICR雄鼠交配后選取見栓的雌鼠。
5、胚胎移植：將注射后的受精卵移植到受體鼠輸卵管壺腹部（移植一次， 120枚卵，4只受體鼠）。
基因型鑒定：
1、剪尾編號：出生7-10天的乳鼠，剪取腳趾和尾尖進行編號及取材。
2、基因組DNA提取： 使用全式金（Transgen）公司的基因組DNA提取試劑盒（EE101-12）提取基因組DNA
3、PCR檢測：根據序列信息設計檢測引物（上海英濰捷基）
M-CTLA4-KO-S 5’AGAAATTATACTCTCCAAGACTCCACG
M-CTLA4-KO-A 5’CCTTAAGTCCCAGCTGAGATCC
KO：
TM=62℃WT：727bp ko:(見測序分析)
PCR反應體系及擴增程序（TaKaRa RR042A）
反應體系：
l10×LA PCRBufferⅡ(Mg2+ Plus)
l2.0 μl
ldNTP Mixture(2.5 μM)
l1.6 μl
l引物-S（50μM ）
l0.2 μl
l引物-A（50μM ）
l0.2 μl
l模板DNA
l2.0 μl
lLA Taq
l0.2 μl
l補加ddH2O至總體積
l20.0μl
擴增程序：
l95℃
l15 min；
l95℃, 30 s
lTM-2℃, 30 s
l72℃, 2 min 30循環；
l72℃
lmin；
6×loading buffer 終止反應。
用1%的瓊脂糖凝膠進行電泳。
4、結果分析： 選取PCR檢測分子量不同于野生型條帶的 (下圖中箭頭所示)，將PCR產物進行TA克隆，之后用檢測引物進行菌液PCR，篩選有插入的克隆測序。
1-23#基因組PCR結果圖（TaKaRa marker DL2000）（上游PCR結果）
1-23#基因組PCR結果圖（TaKaRa marker DL2000）（KO PCR結果）
5、測序結果：
KO：4#，6#，7#，10#，15# 灰色為缺失部分
4#agaaattatactctccaagactccacgtctccaggtcctcagaggtgactcgaagcttcagtttcaagttgagtacattttccatccatggatttgcttgttttgttcagttttagtttgaatatttgaggtcgtctttacgacgtaacagctaaacccacggcttcctttctcgtaaaaccaaaacaaaaaggctctctgttcaggtgtcctgtgtgtgcactacacatatgtagcacgtaccttggatcaaagctgtctatataaagtccccgagtctgtgtgggttcaaacacatctcaaggcttctggatcctgttgggttttactctgctccctgaggacctcagcacatttgccccccagccatggcttgtcttggactccggaggtacaaagctcaactgcagctgccttctaggacttggccttttgtagccctgctcactcttcttttcatcccagtcttctctgaaggtgagtggagacttctggaacatggaggtggaggaggtgtttttcctacatgggtttcgttttttttttttctttcagaagctgaggacagtgatttatagaaatgccagaagttaaagccaaaccctctactttttggtttaacagcttcctacagacaagttccaagaagaatataggaggtctagcagtagcgaaggagctgagactagccacagcagcttgctgggatctcagctgggacttaagg
6#agaaattatactctccaagactccacgtctccaggtcctcagaggtgactcgaagcttcagtttcaagttgagtacattttccatccatggatttgcttgttttgttcagttttagtttgaatatttgaggtcgtctttacgacgtaacagctaaacccacggcttcctttctcgtaaaaccaaaacaaaaaggctctctgttcaggtgtcctgtgtgtgcactacacatatgtagcacgtaccttggatcaaagctgtctatataaagtccccgagtctgtgtgggttcaaacacatctcaaggcttctggatcctgttgggttttactctgctccctgaggacctcagcacatttgccccccagccatggcttgtcttggactccggaggtacaaagctcaactgcagctgccttctaggacttggccttttgtagccctgctcactcttcttttcatcccagtcttctctgaaggtgagtggagacttctggaacatggaggtggaggaggtgtttttcctacatgggtttcgttttttttttttctttcagaagctgaggacagtgatttatagaaatgccagaagttaaagccaaaccctctactttttggtttaacagcttcctacagacaagttccaagaagaatataggaggtctagcagtagcgaaggagctgagactagccacagcagcttgctgggatctcagctgggacttaagg
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3.1.5.2 動物繁殖和表達圖譜分析
獲得F0代后，首先通過與野生型C57小鼠進行雜交，進行基因修飾小鼠傳代能力分析。之后CTLA4敲除小鼠通過雜合子與雜合子雜交，獲得CTLA4敲除小鼠純合子小鼠，進行蛋白表達分析，并用于后續實驗。
3.1.5.3 鼠尾基因組DNA鑒定
在幼崽出生后剪腳趾標記，并剪尾至1.5 mL EP管。然后參照鼠尾直接PCR試劑盒（bimake）說明書按以下程序操作。
1.1. 按小鼠數量配制組織消化液，試劑比例如下：
（單樣本）
Protease Plus
2 μL
Buffer L
100 μL
組織消化液現用現配，充分混勻后使用。
1.2. 向每個含有樣本的EP管中加入100 μL新鮮組織消化液，55℃水浴/金屬浴中消化15 min。組織消化時，務必將組織完全浸沒于消化液中。消化完成后，組織外觀上仍然完整，但足量的基因組DNA已經釋放，不影響后續的PCR實驗。
1.3. 將樣本置于95℃水浴/金屬浴中孵育5 min以滅活消化液中的蛋白酶活性。12000 rpm離心5分鐘，取上清作為PCR模板。消化后的上清或連同組織的消化液可于-20℃保存三個月。
2. PCR擴增2.1. PCR反應體系：
PCR 反應組分
20 μL 反應體系 (μL)
50 μL 反應體系 (μL)
ddH2O
8
21
正向引物 (10 μM)
0.5
1
反向引物 (10 μM)
0.5
1
模板（消化產物）
1
2
2 x M-PCR OPTI? Mix
10
25
注：模板體積可以適當調整。
2.2. PCR反應條件：
溫度 (℃)
時間
循環數
94
5 min
1
94
20 sec
35
60
30 sec
72
X min (2kb/min)
72
5 min
1
12
--
1
3. 瓊脂糖凝膠電泳試劑2 x M-PCR OPTITM Mix中含有溴酚藍染料，PCR產物可直接點樣進行瓊脂糖凝膠電泳。
研究背景
1、造模因素信息
小鼠CTLA4基因位于第一號染色體的1C2區段（Chromosome 1: 60,887,000-60,915,832，ENSMUSG00000026011）
2、實驗動物背景信息
c57bl/6小鼠也被稱為c57 black 6，1921年被培育出來，屬于近交品系。該品系的最主要的兩個特點就是品系穩定和易于繁殖。另外c57bl/6小鼠是第一個完成基因組測序的小鼠品系。
3、研究背景
細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4 (cytotoxic T-lymphocyte associated protein 4，CTLA4)（CD152）和CD28是表達在CD4 +和CD8 + T細胞的同源受體，兩者共享在抗原呈遞細胞表面表達的一對配體，并且在T細胞活化中介導相反的功能。配體與CD28相互作用，介導T細胞與T細胞受體（TCR）信號共刺激。CTLA4最初被發現是一種傳遞抑制信號，對于終止免疫反應非常重要[1, 2]。T細胞活化受到CTLA4的負面調節，例如與CD28競爭與它們共同的配體B7.1和B7.2的結合[3]。盡管CTLA4調節免疫系統的確切機制仍存在爭議，但CTLA4的抑制功能受到廣泛認可[4]。所有CTLA4 敲除小鼠在淋巴結和脾臟均顯示大量淋巴細胞增殖，隨后白細胞對幾乎所有組織進行自身免疫攻擊，并導致小鼠過早死亡[1, 2, 5]。
[1]Waterhouse P, Penninger JM, Timms E, et al. Lymphoproliferative disorders with early lethality in mice deficient in Ctla-4[J]. Science, 1995, 270(5238): 985-8.
[2]Tivol EA, Borriello F, Schweitzer AN, et al. Loss of CTLA-4 leads to massive lymphoproliferation and fatal multiorgan tissue destruction, revealing a critical negative regulatory role of CTLA-4[J]. Immunity, 1995, 3(5): 541-7.
[3]Sharpe AH, Freeman GJ. The B7-CD28 superfamily[J]. Nature reviews Immunology, 2002, 2(2): 116-26.
[4]Egen JG, Kuhns MS, Allison JP. CTLA-4: new insights into its biological function and use in tumor immunotherapy[J]. Nature immunology, 2002, 3(7): 611-8.
[5]Chambers CA, Sullivan TJ, Allison JP. Lymphoproliferation in CTLA-4-deficient mice is mediated by costimulation-dependent activation of CD4+ T cells[J]. Immunity, 1997, 7(6): 885-95.
模型信息
中文名稱:CTLA4敲除小鼠模型
英文名稱:CTLA4 knockout mouse _model
類型:免疫疾病模型
分級:NA
用途:自身免疫疾病研究。
研制單位:中國醫學科學院醫學實驗動物研究所
保存單位:中國醫學科學院醫學實驗動物研究所
