目前認(rèn)為HER的致病機制有三個方面，其一是 HRE結(jié)構(gòu)導(dǎo)致C9orf72 轉(zhuǎn)錄子在細(xì)胞內(nèi)的積累，并可能與DNA形成RNA/DNA 雜交環(huán)（R-loop）引起RNA毒性。 第二種可能是HRE結(jié)構(gòu)可能導(dǎo)致一種叫做不需要ATG的翻譯（repeat-associated non-ATG (RAN)translation ）GGGGCC重復(fù)可以編碼甘胺酸/精氨酸或脯氨酸/精氨酸的多肽，這兩種多肽都有細(xì)胞毒性；其三是C9orf72蛋白本身的異常。由于美國科學(xué)家證實C9orf72基因敲除小鼠主要影響免疫系統(tǒng)，而不是神經(jīng)系統(tǒng)。C9orf72蛋白本身的異常是否也參與ALS的病理發(fā)生仍然是有爭議的科學(xué)問題。

C9ORF72-HRE轉(zhuǎn)基因小鼠具有很明確的ALS的表型，但是該模型只適用于研究，RNA在核內(nèi)的聚集以及蛋白異常結(jié)合引起的細(xì)胞毒性和ATG非依賴性的寡聚肽引起的細(xì)胞毒性。 C9orf72-HER敲入大鼠可能影響C9orf72蛋白本身的表達(dá)， 從而可以研究半合子效應(yīng)導(dǎo)致的C9orf72蛋白本身的異常，以及是否參與ALS的病理發(fā)生。

C9ORF72基因HRE敲入大鼠中C9ORF72蛋白表達(dá)效率下降近50%，自4M開始出現(xiàn)運動功能障礙，隨著年齡的增長，運動功能障礙逐漸加重，并有明顯的漸進(jìn)式下降趨勢，12M后出現(xiàn)后肢癱瘓表型。C9orf72基因HRE敲入可導(dǎo)致運動神經(jīng)元退變，運動神經(jīng)元存活數(shù)量顯著減少。

綜上所述，我們的數(shù)據(jù)顯示C9orf72基因HRE敲入可以導(dǎo)致ALS表型，C9orf72單倍體功能不全可能是導(dǎo)致肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥的相關(guān)因素，提高運動神經(jīng)元中C9orf72水平可作為一種可能的治療策略進(jìn)行檢測。

SD大鼠購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司【SCXK（京）2012-001】。實驗中涉及動物的操作程序已獲得中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所實驗動物使用與管理委員會的批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號為ZLF18003. 本實驗部分使用了基因修飾動物（基因HRE敲入），如果動物逃逸，將會造成的環(huán)境潛在的基因污染。實驗動物飼養(yǎng)繁殖于屏障環(huán)境中，整個實驗過程中保證動物處于監(jiān)管狀態(tài)，無逃脫可能。動物房出入口安放擋鼠板，嚴(yán)防動物逃逸，動物籠具一經(jīng)發(fā)現(xiàn)破損，立即更換，飼養(yǎng)人員出入確保動物房門關(guān)緊并鎖住等。含重組DNA的廢棄核酸樣品、離心管、槍頭等用 1M NaOH溶液浸泡后，裝入密封袋中，統(tǒng)一送到化學(xué)廢棄物處理公司處理。

1，C9ORF72基因HRE敲入大鼠的建立

2，C9ORF72基因HRE敲入影響大鼠免疫功能

3，C9ORF72基因HRE敲入導(dǎo)致的運動缺陷

4，C9ORF72基因HRE敲入導(dǎo)致運動神經(jīng)元丟失

5.1 C9ORF72基因HRE敲入大鼠的建立及大體特征

C9ORF72基因HRE敲入大鼠與野生型SD大鼠經(jīng)雜交，仔代大鼠經(jīng)提取基因組PCR鑒定基因型，包括野生型，HRE敲入雜合子。然后HRE敲入雜合子之間雜交獲得HRE敲入純合子。提取純合子大鼠大腦、小腦、脊髓組織，進(jìn)行免疫印跡觀察C9ORF72蛋白表達(dá)情況，經(jīng)結(jié)果圖灰度掃描定量分析，HRE敲入導(dǎo)致C9ORF72蛋白表達(dá)效率下降近50%。

5.2 C9ORF72基因HRE敲入影響大鼠免疫功能

HRE敲入大鼠體重和生殖能力正常，但與野生型大鼠相比，免疫器官有改變，脾臟無明顯變化，胸腺顯著減小，頸部淋巴結(jié)明顯增大。外周血流式分析顯示4月齡的HRE敲入大鼠中性粒細(xì)胞比例顯著上升，淋巴細(xì)胞中CD3、CD4均顯著降低。至12個月齡，未發(fā)現(xiàn)其他器官有明顯缺陷。

5.3 C9ORF72基因HRE敲入導(dǎo)致的運動缺陷

采用運動協(xié)調(diào)實驗和肢體力量實驗測定4M、8M、12M的WT和KI大鼠的運動功能。KI大鼠從4M開始出現(xiàn)運動功能障礙，隨著年齡的增長，運動功能障礙逐漸加重，并有明顯的漸進(jìn)式下降趨勢。與WT相比KI大鼠12M時運動協(xié)調(diào)和肢體力量下降分別為68%和56%。雌性KI大鼠在13-24M年齡段后肢麻痹發(fā)生率為25%(5/20)。這些數(shù)據(jù)表明，敲除大鼠的HRE插入不僅會導(dǎo)致運動障礙，還會導(dǎo)致后肢麻痹。

運動協(xié)調(diào)實驗：兩組動物分別測量4M、8M、12M三個時間點的從轉(zhuǎn)棒儀掉落時間，實驗前先進(jìn)行4次適應(yīng)性訓(xùn)練，正式實驗300s為測量上限，每只動物重復(fù)三次，清理消毒后進(jìn)行下一組，整個實驗在安靜環(huán)境下進(jìn)行。（大小鼠轉(zhuǎn)棒儀DXP-3，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所）

肢體力量實驗：兩組動物分別測量4M、8M、12M三個時間點的后肢抓力，每只動物重復(fù)三次。（抓力儀 bio-gs3 Bioseb US ）

5.4 C9ORF72基因HRE敲入導(dǎo)致運動神經(jīng)元丟失

12M大鼠灌流固定取脊髓脊髓，計數(shù)腰椎脊髓節(jié)段處焦油紫染色的運動神經(jīng)元數(shù)目，以確定其退變的程度。C9orf72基因HRE敲入引起運動神經(jīng)元的退變，與WT相比，HRE敲入大鼠的運動神經(jīng)元存活數(shù)量顯著減少了47%。這一結(jié)果表明C9orf72基因HRE敲入可導(dǎo)致運動神經(jīng)元退變，提示C9orf72基因HRE敲入增加了運動神經(jīng)元對其他應(yīng)力的敏感性。

神經(jīng)元焦油紫（cresylviolet）染色：4%多聚甲醛灌流固定，取脊髓腰段，40um脊髓冰凍切片，脫水處理后-30℃保存。雙蒸水配置焦油紫0.1%M/V，冰凍切片室溫平衡后，PBS水化1min，0.1%焦油紫浸染2小時，雙蒸水浸洗至組織呈深紫色，分化、脫水（過程中密切觀察組織顏色，直至淡紫色），封片。

3.1實驗材料

3.1.1實驗動物

SD大鼠購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司【SCXK（京）2012-001】。實驗中涉及動物的操作程序已獲得中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所實驗動物使用與管理委員會的批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號為ZLF18003.

3.1.2實驗儀器

3.1.3實驗試劑

3.1.4模型構(gòu)建流程

(1) 設(shè)計方案

(2) 構(gòu)建sgRNA 載體pUC57-sgRNA expression vector，根據(jù)基因信息選擇靶點并合成sgRNA。靶點1:AGTCCCACGAGGAAACAG CGG靶點2:AGGCAACCAGAGCGCTGG CGG(3) 合成的sgRNA單鏈通過退火復(fù)性結(jié)合成小片段，插入BSA I線性化的載體，構(gòu)建完成的sgRNA載體通過體外轉(zhuǎn)錄成為可注射的sgRNA。(4) 構(gòu)建Cas9載體pST1374-NLS-flag-linker-Cas9，載體通過體外轉(zhuǎn)錄成為可注射的Cas9-RNA。(5) 顯微注射 1) 超數(shù)排卵：15只3-4周齡SD雌鼠注射激素進(jìn)行超排。 2) 受精卵注射：取約150枚受精卵進(jìn)行注射。 3) 雄鼠結(jié)扎：制作30只8周齡輸精管結(jié)扎的SD雄鼠。 4) 受體鼠制備：8-10周齡SD雌鼠與結(jié)扎的SD雄鼠交配后選取見栓的雌鼠。 5) 胚胎移植：將注射后的受精卵移植到受體鼠輸卵管壺腹部（移植一次，150枚卵，5只受體鼠）。(6) 基因型鑒定 1) 剪尾編號：出生7-10天的乳鼠，剪取腳趾和尾尖進(jìn)行編號及取材。 2) 基因組DNA提取：使用基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA 3) PCR檢測：根據(jù)序列信息設(shè)計檢測引物并進(jìn)行PCR檢測。(7) 結(jié)果分析：選取通過PCR檢測后含有不同于野生型分子量條帶的鼠號，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行TA克隆，之后用檢測引物進(jìn)行菌液PCR，篩選有插入的克隆測序。(8) 根據(jù)測序結(jié)果確定C9ORF72基HRE敲入模型大鼠（SD. C9ORF72 (tm)-GC/ILAS，http://www.ratresource.com）用于后續(xù)實驗。

一、疾病概述

肌萎縮側(cè)索硬化（ALS）也叫運動神經(jīng)元病（MND），后一名稱英國常用，法國又叫夏科（Charcot）病，而美國也稱盧伽雷（Lou Gehrig）病。我國通常將肌萎縮側(cè)索硬化和運動神經(jīng)元病混用。它是上運動神經(jīng)元和下運動神經(jīng)元損傷之后，導(dǎo)致包括球部（所謂球部，就是指的是延髓支配的這部分肌肉）、四肢、軀干、胸部腹部的肌肉逐漸無力和萎縮。患病率約為4-6/10萬。大約10%的ALS病例是家族型的，90%是散發(fā)型的。

2018年5月11日，國家衛(wèi)生健康委員會等5部門聯(lián)合制定了《第一批罕見病目錄》，肌萎縮側(cè)索硬化被收錄其中。

病因

肌萎縮側(cè)索硬化的病因至今不明。20%的病例可能與遺傳及基因缺陷有關(guān)。另外有部分環(huán)境因素，如重金屬鋁中毒等，都可能造成運動神經(jīng)元損害。產(chǎn)生運動神經(jīng)元損害的原因，目前主要理論有：神經(jīng)毒性物質(zhì)累積，谷氨酸堆積在神經(jīng)細(xì)胞之間，久而久之，造成神經(jīng)細(xì)胞的損傷；自由基使神經(jīng)細(xì)胞膜受損；神經(jīng)生長因子缺乏，使神經(jīng)細(xì)胞無法持續(xù)生長、發(fā)育。

臨床癥狀

該病早期癥狀輕微，易與其他疾病混淆。患者可能只是感到有一些無力、肉跳、容易疲勞等一些癥狀，漸漸進(jìn)展為全身肌肉萎縮和吞咽困難。最后產(chǎn)生呼吸衰竭。

依臨床癥狀大致可分為兩型：

1.肢體起病型

癥狀首先是四肢肌肉進(jìn)行性萎縮、無力，最后才產(chǎn)生呼吸衰竭。

2.延髓起病型

先期出現(xiàn)吞咽、講話困難，很快進(jìn)展為呼吸衰

診斷

要早期診斷肌萎縮側(cè)索硬化，除了神經(jīng)科臨床檢查外，還需做肌電圖、神經(jīng)傳導(dǎo)速度檢測、血清特殊抗體檢查、腰穿腦脊液檢查、影像學(xué)檢查，甚至肌肉活檢。

1.病史采集和神經(jīng)系統(tǒng)檢查

診斷過程的第一個重要步驟，就是由神經(jīng)科醫(yī)生進(jìn)行的臨床接診。進(jìn)行包括詳細(xì)的現(xiàn)病史，家庭史，工作和環(huán)境接觸史的采集。接診過程中，神經(jīng)科醫(yī)生將尋找肌萎縮側(cè)索硬化的典型表現(xiàn)：

（1）檢查要評估咀嚼和吞咽的肌肉力量，包括口腔、舌及咽喉肌。

（2）下運動神經(jīng)元（LMN）功能，如肌肉萎縮情況，肌肉力量或肌肉跳動（稱為肌束震顫）。

（3）上運動神經(jīng)元（UMN）功能，如腱反射亢進(jìn)和肌肉痙攣（肌肉緊張和僵直的程度）

（4）情緒反應(yīng)失去控制，如哭或笑的情緒變化。思維的變化如喪失判斷力或失去基本的社會技能。檢查者也會評估患者言語流暢性及文字識別能力。這些癥狀不常見，不容易引起重視。

（5）神經(jīng)科醫(yī)生還將詢問如疼痛，感覺喪失或錐體外系問題。

2.輔助檢查

診斷過程的下一步往往是一系列的輔助檢查，如頸部MRI（磁共振成像）、頭和腰MRI，EMG（肌電圖）、神經(jīng)傳導(dǎo)速度和血液化驗。有時會做基因檢測或腰椎穿刺。

（1）磁共振成像（MRI）是一種無痛、非侵入性的檢查，能非常詳細(xì)提供脊髓和環(huán)繞、保護(hù)脊髓的骨骼及結(jié)締組織的結(jié)構(gòu)。將有助于除外對脊髓或主要神經(jīng)的壓迫（如突出的椎間盤）、多發(fā)性硬化、骨腫瘤壓迫神經(jīng)等異常、脊髓或腦中風(fēng)。

（2）肌電圖（EMG）是診斷過程一個非常重要的部分。該檢查有時不舒服，但有必要完成。第一部分通過小型電極在特定部位發(fā)送刺激經(jīng)過所檢測的神經(jīng)，在另一部位接受信號。根據(jù)所需時間測定傳導(dǎo)速度以判斷是否有神經(jīng)損傷。第二部分測試選定肌肉的電活動。通過很細(xì)的針插入到選定的肌肉，并用它來“聽”這些肌肉的電活動模式。

（3）血液、尿液和其他檢查驗血是為了篩查其他疾病，有些疾病癥狀類似肌萎縮側(cè)索硬化早期跡象。這些檢查包括甲狀腺或甲狀旁腺疾病、維生素B12缺乏、艾滋病毒感染、肝炎、自身免疫性疾病以及某些類型的癌癥。肌酸激酶（CK）是肌肉受傷或死亡釋放的酶，也常檢查。其他還包括自身免疫抗體、抗-GM1抗體檢測，尋找可能與某些癌癥有關(guān)的血液標(biāo)志物。根據(jù)患者工作和環(huán)境，也可能做重金屬檢測。如果家庭里其他成員患肌萎縮側(cè)索硬化應(yīng)該做肌萎縮側(cè)索硬化基因檢測。有時可能需要腰穿。有些患者除無力外，有疼痛或肌酸磷酸激酶（CK）非常高的表現(xiàn)，可能需要肌肉活檢。

3.診斷

這些檢查完成后，有經(jīng)驗的神經(jīng)科大夫就可以判斷患者是否為肌萎縮側(cè)索硬化。有時確診所需要的癥狀和檢查結(jié)果并非都異常（尤其是在疾病的最早階段）。在這種情況下，神經(jīng)科大夫會檢查建議隨診，3個月后重復(fù)體檢和肌電圖。

二、模型背景

1、基因信息

C9ORF72基因,Gene ID: 313155。

2、實驗動物背景信息

SD大鼠

3、研究背景

肌萎縮側(cè)索硬化癥（ALS）是一種累進(jìn)性神經(jīng)退行疾病，以控制肌肉收縮的上、下運動神經(jīng)元選擇性退化和凋亡為特征，引發(fā)癱瘓、最終導(dǎo)致死亡，患病率約為4-6/10萬。大約10%的ALS病例是家族型的，90%是散發(fā)型的。從發(fā)現(xiàn)SOD1基因突變到現(xiàn)在，共確定了30余種致病基因，其中C9orf72，F(xiàn)US，TARDBP，SOD1等比例較高，而EPHA4， ATXN2等20余種基因比率較低[1-5]。肌萎縮側(cè)索硬化癥病因涉及興奮毒性、氧化應(yīng)激、神經(jīng)營養(yǎng)因子、自身免疫、中毒、感染等，目前無有效的治療方法，仍然是 “不治之癥”。

已發(fā)現(xiàn)的30種致病基因和修飾基因與ALS的病理發(fā)生有關(guān)，其機制可歸納為細(xì)胞表面受體、RNA加工、蛋白質(zhì)合成、能量代謝、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能、軸突轉(zhuǎn)運等幾個方面的異常。其中C9orf72和EPHA4分別參與了RNA加工、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細(xì)胞膜受體三種ALS的發(fā)病機制。

C9orf72的第一外顯子E1a和E1b之間有GGGGCC六個堿基的重復(fù)序列（HRE)，HRE拷貝數(shù)在人群中具有多態(tài)性，高于30個重復(fù)會有發(fā)生額顳葉癡呆（FTD）或ALS，在西方人群HER引起的ALS占了家族型病例的40%和散發(fā)型病例的7-10%， 臺灣漢人中分別為18% 和2%， 我國目前研究較少，128個ALS-FTD 病人中發(fā)現(xiàn)2例[7-8]。可能漢人的頻率比西方人低，但總體上仍然是最主要的致病基因，除次之外，HRE引起 30% 的FTD和1-2%的老年性癡呆（AD） [9]，我國的研究發(fā)現(xiàn)，HER結(jié)構(gòu)也可能是帕金森的危險因素。C9orf72是與多種退行性神經(jīng)疾病相關(guān)的重要致病基因和靶點。

C9orf72蛋白與細(xì)胞運輸和自噬有關(guān)，敲低斑馬魚的C9orf72表達(dá)可干擾神經(jīng)分支的形成和縮短運動神經(jīng)元軸突[10，11]，推測HER導(dǎo)致ALS的致病機制有二個方面（1）HRE結(jié)構(gòu)導(dǎo)致C9orf72 轉(zhuǎn)錄子在細(xì)胞內(nèi)的積累并與DNA形成RNA/DNA 雜交環(huán)（R-loop）引起RNA毒性；或?qū)е虏恍枰狝TG的翻譯（RAN translation ）甘胺酸/精氨酸或脯氨酸/精氨酸的多肽的細(xì)胞毒性；（2）C9orf72表達(dá)水平降低影響了神經(jīng)元內(nèi)細(xì)胞運輸[12-14]。

ALS動物模型是研究ALS的病因、病理、發(fā)病機制和治療的重要工具。目前建立ALS的嚙齒類動物模型主要是SOD1、TDP-43、VCP、FUS等基因的轉(zhuǎn)基因或基因敲除小鼠，wobbler自發(fā)突變小鼠，不同模型病理表現(xiàn)不同，并各自局限性[15-17]。目前常用的嚙齒類動物模型只反映了10%左右的病因，需要覆蓋更廣泛病因的和基因敲入動物模型的研制。

ALS之所以仍然是臨床的“不治之癥”的主要原因是其病因多樣，目前對其機制了解少，針對性的發(fā)展相應(yīng)的治療靶點和藥物比較困難。 ALS疾病模型的不足也是ALS研究的限制限制因素之一。目前比較常用的模型綜合起來涵蓋的致病機制不超過10%。 建立能覆蓋較大部分發(fā)病機制的ALS模型，可以極大地促進(jìn)起發(fā)病機制研究、藥物研發(fā)和治療方法研究。

HRE序列多態(tài)性和基因缺失是目前國際公認(rèn)的最普遍的ALS治病基因。在斑馬魚中敲低C9orf72基因和在果蠅中表達(dá)HER序列都能造成一定的神經(jīng)表型，但與患者的基因結(jié)構(gòu)不同，不能再現(xiàn)ALS表型[11，12]。將HER-GFP表達(dá)盒轉(zhuǎn)入小鼠并沒有ALS表型[18]，啟示將HER結(jié)構(gòu)敲入到C9orf72位點是造成ALS表型所必需的，但C9orf72的HER結(jié)構(gòu)敲入和C9orf72敲除的哺乳動物模型尚未研制成功。

大鼠在生理、行為、神經(jīng)等研究最常用的實驗動物[21]，大鼠神經(jīng)系統(tǒng)疾病模型不僅有好的行為學(xué)表現(xiàn)，也能表現(xiàn)一些在小鼠模型上不能表現(xiàn)的病理改變。我們推測C9ofr72基因修飾大鼠模型將比小鼠有更好的表型。 而我們實驗室在國際上率先建立了系統(tǒng)的CRISPR/cas9 介導(dǎo)的、率的大鼠基因條件敲除、敲入技術(shù)體系[22]，建立C9ofr72基因修飾大鼠沒有技術(shù)障礙。

綜上，ALS影響的不僅僅是病人，也是對社會和家庭影響很大的“不治之癥”，而目前國際上尚未建立基于C9orf72基因的哺乳類動物模型建立這類模型對我國ALS、FTD和AD等神經(jīng)退行性疾病的醫(yī)藥研究具有重要的推動作用。

參考文獻(xiàn)：

1.Amyotrophic lateral sclerosis associated with homozygosity for an asp90-to-ala mutation in CuZn-superoxide dismutase. Nature Genet. 10: 61-66, 1995

2.C9orf72 nucleotide repeat structures initiate molecular cascades of disease.Nature.2014，13;507(7491):195-200.

3.Fishing for causes and cures of motor neuron disorders. Dis Model Mech. 2014 Jul;7(7):799-809

4.Mutations of optineurin in amyotrophic lateral sclerosis.Nature. 2010 May 13;465(7295):223-6.

5.State of play in amyotrophic lateral sclerosis genetics.Nat Neurosci.2014;17(1):17-23.

6.A hexanucleotide repeat expansion in C9ORF72 is the cause of chromosome 9p21-linked ALS-FTD.Neuron. 2011，20;72(2):257-68.

7.Expanded GGGGCC hexanucleotide repeat in noncoding region of C9ORF72 causes chromosome 9p-linked FTD and ALS.Neuron. 2011，20;72(2):245-56.

8.A hexanucleotide repeat expansion in C9ORF72 causes familial and sporadic ALS in Taiwan.Neurobiol Aging.2012，;33(9):2232.

9.Repeat expansion in C9ORF72 in Alzheimer's disease.N Engl J Med. 2012, 9;366(3):283-4.

10.C9ORF72, implicated in amytrophic (sic) lateral sclerosis and frontotemporal dementia, regulates endosomal trafficking. Hum. Molec. Genet. 23: 3579-3595, 2014.

11.Loss of function of C9orf72 causes motor deficits in a zebrafish model of amyotrophic lateral sclerosis. Ann. Neurol. 74: 180-187, 2013.

12.C9orf72 repeat expansions cause neurodegeneration in Drosophila through arginine-rich proteins. Science. 2014, 345(6201):1192–1194.

13.C9orf72 nucleotide repeat structures initiate molecular cascades of disease.Nature. 2014, 13;507(7491):195-200.

14.The C9orf72 GGGGCC repeat is translated into aggregating dipeptide-repeat proteins in FTLD/ALS. Science 339: 1335-1338, 2013.

15.Neurodegenerative disease: EPHA4 inhibition rescues neurodegeneration in ALS.Nat Rev Drug Discov. 2012 Oct;11(10):747.

16.EPHA4 is a disease modifier of amyotrophic lateral sclerosis in animal models and in humans.Nat Med. 2012 Sep;18(9):1418-22.

17.GrimesMouse models of ciliopathies: the state of the art. Dis Model Mech. 2012, 5(3): 299–312.

18.Rodent models of amyotrophic lateral sclerosis. Biochimica et Biophysica Acta 1832 (2013) 1421–1436.

19.The wobbler mouse, an ALS animal model. Mol Genet Genomics. 2013; 288(5-6): 207–229.

20.A new inducible transgenic mouse model for C9orf72-associated GGGGCC repeat expansion supports a gain-of-function mechanism in C9orf72 associated ALS and FTD.Acta Neuropathol Commun. 2014, 13;2(1):166.

21.Laboratory animals: the Renaissance rat.Nature. 2004, 428(6982):464-6.)

22.Generating rats with conditional alleles using CRISPR/Cas9.Cell Res. 2014 , 24(1):122-5.