該模型通過(guò)長(zhǎng)期觀察普通狼瘡小鼠模型，待其到40周齡時(shí)，檢測(cè)其dsDNA等，結(jié)合皮膚癥狀變化，來(lái)確定慢性狼瘡皮膚病模型的建立。目前國(guó)際上尚欠缺類(lèi)似模型，為研究狼瘡皮膚病發(fā)病機(jī)制提供了工具。

模型動(dòng)物飼養(yǎng)在武漢大學(xué)人民醫(yī)院動(dòng)物房SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證SYXK（鄂）2015-0027。

（1）建筑特點(diǎn)

門(mén)采用專(zhuān)用凈化密閉門(mén)并配備觀察窗。單向走道呈順時(shí)針走向設(shè)計(jì)。屏障系統(tǒng)內(nèi)共有大鼠飼養(yǎng)室1間，小鼠飼養(yǎng)室3間，隔離觀察室1間，實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備室1間，潔物存放室1間，清洗消毒室1間。此外，屏障系統(tǒng)外配有監(jiān)控室、機(jī)房和配電室等。

（2）設(shè)計(jì)參數(shù)

室內(nèi)溫度：20～26°C；日溫差：≤4°C；相對(duì)濕度：40%～70%；換氣次數(shù)：15～20次/h；氣流速度：≤0．2m/s；壓強(qiáng)梯度：20～50Pa；空氣潔凈度：7級(jí)；菌落數(shù)：≤3個(gè)/皿；氨濃度：≤14mg/m3；噪聲：≤60dB；Z低工作照度：≥200lx；動(dòng)物照度：15～20lx；晝夜明暗交替時(shí)間：12/12h。

（3）通風(fēng)和空調(diào)系統(tǒng)

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室采用全新風(fēng)中央空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)。空氣經(jīng)過(guò)初、中、三級(jí)過(guò)濾器后進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室內(nèi)環(huán)境。

（4）照明系統(tǒng)

一更、淋浴、二更、氣閘、清潔走道、潔物存放處、污物走道、緩沖間和清洗消毒間、動(dòng)物飼養(yǎng)室、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備間、隔離觀察室和功能實(shí)驗(yàn)室等安裝有手動(dòng)和自動(dòng)開(kāi)關(guān)，根據(jù)實(shí)際需要，調(diào)節(jié)控制室內(nèi)照明燈。未啟用房間、清潔走道、潔物存放處、污物走道等在每日中午12點(diǎn)和晚上8點(diǎn)開(kāi)啟紫外線燈照射1h。

（5）通訊系統(tǒng)

因?yàn)镾PF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境和設(shè)施具有特殊要求，人員進(jìn)入后不能隨意出入，而室內(nèi)外的聯(lián)系又十分重要，故室內(nèi)各房間均安裝內(nèi)部電話機(jī)，按照房間順序編排電話號(hào)碼，各室內(nèi)電話可相互連通，并均與監(jiān)控室總機(jī)保持聯(lián)系，保證實(shí)驗(yàn)室內(nèi)外信息的及時(shí)溝通。

（6）監(jiān)控系統(tǒng)

對(duì)SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室的出入口、走道、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)室、功能操作室等重要位置均安裝了可作270°旋轉(zhuǎn)的攝像機(jī)，能夠及時(shí)了解設(shè)施的運(yùn)行狀態(tài)；也能有效督促實(shí)驗(yàn)人員執(zhí)行科學(xué)的操作規(guī)程，避免人為因素造成室內(nèi)環(huán)境和設(shè)施的污染；并對(duì)整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間的動(dòng)物狀態(tài)和反應(yīng)進(jìn)行觀察，減少對(duì)動(dòng)物的滋擾。

（7）供水系統(tǒng)

SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飲用水以純凈水為宜。本實(shí)驗(yàn)室采用管道供水，將處理后的純凈水用塑膠管道輸送到屏障系統(tǒng)內(nèi)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備室，設(shè)置接水槽，為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物供應(yīng)滅菌的飲用水和屏障系統(tǒng)內(nèi)用水。要經(jīng)常更換和清洗輸水管道，清洗籠具的用水添加適當(dāng)比例的84消毒液。

（8）供電系統(tǒng)、警報(bào)系統(tǒng)和消防設(shè)施

SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室要求全天候不間斷供風(fēng)和供電，如果出現(xiàn)故障，不能及時(shí)發(fā)現(xiàn)和處理，就可能導(dǎo)致環(huán)境設(shè)施的污染、動(dòng)物感染或死亡，造成嚴(yán)重后果。因此應(yīng)對(duì)SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室使用獨(dú)立穩(wěn)定的供電系統(tǒng)，并配備有應(yīng)急電源。在中央空調(diào)機(jī)房控制室安裝風(fēng)機(jī)故障警報(bào)系統(tǒng)，以便及時(shí)檢修和維護(hù)，保證設(shè)施的安全運(yùn)行。

（9）消毒滅菌設(shè)備

為防止外界物品進(jìn)入SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室時(shí)所攜帶的細(xì)菌污染室內(nèi)環(huán)境和造成動(dòng)物交叉感染，按照不同物品的特性，進(jìn)行紫外線照射消毒、渡槽消毒液消毒或?qū)Ｓ玫臋C(jī)動(dòng)門(mén)真空滅菌器消毒。

（10）動(dòng)物飼養(yǎng)籠具

飼養(yǎng)大、小鼠的籠具聚碳酸脂材料的塑膠籠具，具有高透明、耐高壓、耐高溫、耐酸堿等特點(diǎn)。通用的不銹鋼籠具長(zhǎng)、寬、高分別為40、30、20cm，適用于單籠飼養(yǎng)有特殊要求的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，配有底盤(pán)和食槽，確保實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有充足的采食和活動(dòng)空間，同時(shí)也保證室內(nèi)環(huán)境的清潔。

（11）墊料的選擇和使用

在使用塑膠墊料時(shí)，墊料是大小鼠直接接觸的鋪墊物，起到吸濕、保暖和造窩的作用。墊料的好壞直接影響到大小鼠術(shù)后的恢復(fù)、生長(zhǎng)發(fā)育和繁殖性能。目前，所使用的墊料主要有玉米秸墊料、刨花墊料。

（12）飼料配制

大小鼠的生產(chǎn)型飼料和維持型飼料必須嚴(yán)格按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行科學(xué)配制生產(chǎn)。每半年檢測(cè)一次飼料的微生物指標(biāo)和有效營(yíng)養(yǎng)成分指標(biāo)，保證飼料的質(zhì)量。

1. 動(dòng)物癥狀觀察高膽固醇、高糖、高脂飲食的三組幼體體長(zhǎng)均比 WT 組幼體體長(zhǎng)增長(zhǎng)。但高膽固醇、高脂飲食導(dǎo)致斑馬魚(yú)體重增加、肝區(qū)擴(kuò)大，高脂組的幼體腹部和頭部的透明度明顯降低。高糖組體重未見(jiàn)變化，但頭部和內(nèi)臟區(qū)透明度也明顯下降(圖 1)。

圖1. 高膽固醇、高糖或高脂飲食對(duì)斑馬魚(yú)幼體生長(zhǎng)的影響(A) 四組不同飼喂方案；(B) 四組飲食飼喂終點(diǎn)時(shí)的幼體表型；(C) 幼體在15 dpf 的平均體3長(zhǎng) (n = 20).；和平均體重(n = 10，每組從100條中隨機(jī)取10條幼體稱(chēng)重）。a, 與對(duì)照組比較; b,與EF組比較; c, 與HF組比較; *P < 0.05, #P < 0.01; Bar = 1 mm.2. 病理改變體內(nèi)總膽固醇和總脂升高，顯微鏡下可見(jiàn)肝臟有明顯脂質(zhì)蓄積和脂肪泡，肝結(jié)構(gòu)改變（圖 2）。生化指標(biāo)檢測(cè)顯示：過(guò)量飲食組的總脂質(zhì)/甘油三酯、膽固醇和葡萄糖均明顯高于對(duì)照組。膽固醇組的總脂質(zhì)/膽固醇明顯高于對(duì)照組，甘油三酯略高，葡萄糖低于對(duì)照組。高糖組的總脂質(zhì)、甘油三酯和葡萄糖均高于對(duì)照組，而膽固醇水平與對(duì)照相當(dāng)（圖 2F-I）。

圖 2. 脂質(zhì)在斑馬魚(yú)幼體體內(nèi)的蓄積A. 油紅染色示不同飲食組的幼體肝區(qū)脂質(zhì)水平；B. 示四組幼體肝區(qū)膽固醇的蓄積水平；C. 示四組幼體軀干血管的膽固醇水平； D. 肝臟冰凍切片和油紅 O 染色顯示脂質(zhì)在肝區(qū)的蓄積和脂肪變性；E. 肝臟石蠟切片和 H.E 染色顯示肝小葉排列變化和肝細(xì)胞內(nèi)脂肪泡情況；F. 油紅染色陽(yáng)性區(qū)半定量統(tǒng)計(jì)比較；G. 膽固醇與每毫克蛋白之比；H. 甘油三酯與每毫克蛋白之比；I. 糖與每毫克蛋白之比。F-I 數(shù)據(jù)來(lái)自斑馬魚(yú)肝臟。*P < 0.05 vs. Control. Bar =100 μm。

1. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

野生型斑馬魚(yú) AB 品系。

2. 造模化合物及斑馬魚(yú)處理

采用高脂、高糖、高膽固醇三種飲食方案飼喂斑馬魚(yú)幼體。具體方案見(jiàn)圖1（Ref.1）。主要步驟：取野生型斑馬魚(yú)幼體(5 dpf)，隨機(jī)分為4組：正常飲食(30mg/d AP100)、高膽固醇(30 mg/d AP100 plus 4% (w/w) cholesterol)、高糖(30 mg/dAP100 plus 0.25%(w/v) fructose)、高脂(180 mg/d AP100)，按照gezi 飲食方案飼喂10天。飼喂終止后，空腹過(guò)夜，收集幼體進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。為了觀察膽固醇在體內(nèi)的分布，在4組食物中添加BODIPY 標(biāo)記的膽固醇(10μg/g cholesterylBODIPY 542/563-C11, Invitrogen)。

3. 模型分析指標(biāo)

（1） 癥狀觀察2觀察和拍照斑馬魚(yú)表型；測(cè)量斑馬魚(yú)幼體體長(zhǎng)和稱(chēng)重，統(tǒng)計(jì)學(xué)處理并比較 4組數(shù)據(jù)。

（2） 病理檢測(cè)A. 對(duì)斑馬魚(yú)整體進(jìn)行油紅染色，檢測(cè)體內(nèi)脂質(zhì)蓄積水平和分布；熒光顯微鏡下觀察 BODIPY 標(biāo)記的膽固醇在體內(nèi)的分布和強(qiáng)度。B. 肝臟冰凍切片和油紅 O 染色；C. 肝臟石蠟切片和 H.E 染色。

（3） 病理診斷 采用肝臟組織切片和 HE 染色檢測(cè)，以脂質(zhì)/膽固醇在肝臟蓄積、或以大泡性為主的肝細(xì)胞脂肪變性為特征。

一、疾病名稱(chēng)

非酒精性脂肪性肝病（Non-Alcoholic Fatty Liver Disease, NAFLD）

二、臨床發(fā)病機(jī)制及癥狀

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)被認(rèn)為是僅次于酒精和病毒性肝炎導(dǎo)致肝硬化的第三大病因。NAFLD 是指除外酒精和其他明確的肝損傷因素所致的，以彌漫性肝細(xì)胞大泡性脂肪為主要特征的臨床病理綜合征，包括單純性脂肪性肝病以及由其演變的脂肪性肝炎和肝硬化。肥胖、II 型糖尿病、高脂血癥等單獨(dú)或共同成為 NAFLD 的誘因。NAFLD 多伴有中心性肥胖、胰島素抵抗和脂質(zhì)代謝紊亂，也被認(rèn)為是代謝綜合征的一種表現(xiàn)。病理特征：以大泡性或以大泡性為主的肝細(xì)胞脂肪變性為特征。

三、模式動(dòng)物

斑馬魚(yú)(Zebrafish, Danio rerio) AB 或 TU 野生型品系均可。